祭遵少好经书，其家虽富，但祭遵却十分节俭，常穿破旧的衣服。其母去世，他亲自背土，垒造坟茔。曾有部吏欺凌他，被他结交侠士杀死。开始，县城中人认为他柔弱怯懦，此事之后，人们就都畏惧他的胆识了。
刘秀在昆阳击败王寻(参见昆阳之战)，回军经过颍阳。祭遵以县吏的身份几次进见。刘秀喜欢他的风度容仪，任命他为门下史。
后来，他随军进攻河北，担任军市令。一次，有个伺侯刘秀的小郎犯了法。祭遵毫不客气，当场处死了他。刘秀得知，十分恼怒，下令收捕祭遵，加以惩处。主薄陈副劝阻说：“明公常想让众军整肃。现在祭遵执法毫无避忌袒护，正是助您教令诸军的好机会。”刘秀这才赦免了祭遵，并任命他为刺奸将军。事后，刘秀常对将领们说：“当备祭遵！吾舍中儿犯法尚杀之，必不私诸卿也。”(《后汉书》)不久，祭遵又升任偏将军，随从刘秀平定河北，因功受封为列侯。
建武二年(26年)春，光武帝刘秀任命祭遵为征虏将军，定封颍阳侯。让他和骠骑大将军景丹，建义大将军朱佑，汉忠将军王常，骑都尉王梁、臧宫等人进军箕谷，攻打弘农(今河南灵宝东北)、厌新、柏华、蛮中的敌兵。作战中，敌人的弩箭射到祭遵的嘴上，伤口流血不止。众将见祭遵受伤，渐生退意，阵脚移动。祭遵不顾伤痛，大声呵止。士兵见祭遵如此刚强，勇气百倍，终于大破敌兵。
盘踞在新城、蛮中一带的山贼张满，屯驻险要地方，为害百姓。朝廷命祭遵前去讨伐。祭遵先断绝了张满的粮道，然后坚守营垒，坚壁不出。这时，厌新、柏华等地的残敌又和张满呼应，攻占霍阳聚。祭遵抓住有利时机，分兵将他们各个击破。第二年春，张满无衣无食，陷入困境。祭遵攻破城邑，生擒张满，将其处死。接着，祭遵率兵南进，在杜衍击败邓奉的弟弟邓终。
十月，涿郡太守张丰扣留汉使，起兵反汉，自称无上大将军，并与彭宠连兵。建武四年(28年)，祭遵与朱佑、建威大将军耿?、骁骑将军刘喜率部前往讨伐。祭遵先到涿郡，统兵攻城，势如急风骤雨。张丰的功曹抓获张丰，献城归降。
原来，张丰喜好方术，有一道士投其所好，说他应为天子，并把五色彩囊包上石头，挂在他的肘后，骗他说石头中有玉玺。张丰深信不疑，于是造反。一直到被擒获将要问斩，张丰还说：“肘石中有玉玺”。祭遵命人将石头砸碎，张丰才知被骗，连叹该死。
诸将率军撤回，祭遵则奉诏屯驻留乡，抵拒彭宠。他派护军傅玄袭击彭宠的将领李豪，结果大获全胜，斩首千余敌人。祭遵和彭宠对持一年多。屡次打败彭宠，挫其锋芒。彭宠同伙，有许多都投降了祭遵。建武五年(29年)，彭宠被他的苍头所杀，祭遵乘势进军，平定其地。
建武六年(30年)春，光武帝命祭遵和建威大将军耿?、虎牙大将军盖延、汉忠将军王常、捕虏将军马武、骁骑将军刘歆、武威将军刘尚等从天水进军，讨伐公孙述，并事先诏告隗嚣。部队行至长安，光武帝也赶到了。隗嚣不愿让汉兵经陇道进军，上书设辞，说；“白水险阻，栈阁绝败，难以行走。”光武帝召集众将，议决此事。将领们都说“可且延嚣日月之期，益封其将帅，以消散之。”只有祭遵持不同意见。他说：“嚣挟奸久矣。今若按甲引时，则使其诈谋益深，而蜀警增备，固不如遂进。”(《后汉书?祭遵列传》)光武帝认为他说得对，便派他为先行。隗嚣派他的将领王元据守陇坻(今陕西陇县，甘肃清水之间)，伐木塞道，以挡汉军。祭遵鼓勇进攻，击败王元，追至新关。等到诸将到来，与隗嚣作战，纷纷失利，退兵下陇。于是，光武帝命祭遵驻?(今陕西陇县南)，耿?驻漆，征西大将军冯异驻?邑，大司马吴汉等还屯长安。此役之后，祭遵又数挫隗嚣，事在冯异传。
建武八年(32年)秋，祭遵又随光武帝由陇道西上，出征隗嚣。不久，隗嚣由略阳败退，光武帝东归，经过?县，特意到祭遵营中犒赏士卒，演奏黄门武乐，夜深才罢。当时，祭遵重病在身。光武帝特赐以重茵，覆以御盖，关切倍至。命令他进驻陇下。后来，公孙述派兵救援隗嚣，吴汉、耿?等撒军逃回，只有祭遵留在驻地，独守冲难，没有退却。
建武九年(33年)，祭遵病死军中。
祭遵为人廉约小心，克己奉公，他得到赏赐，都分给部下，不治产业，家无余财。自己一生，穿皮裤，盖布被。夫人也裳不加缘，简朴至极。他兄长祭午见他没有儿女，便做主娶了一妾给他送去。祭遵坚决不受。他认为自己身荷国家重任，因而不敢图生虑继嗣之计。临死时，他告诉家人将自己用牛车拉回，薄葬洛阳。问他家中之事，他一句也不说，“清名闻于海内，廉白著于当世”，“任重道远，死而后己。”
祭遵竭诚奉公，尽忠为国。他一生戎马倥偬，北平渔阳，西拒陇蜀，先登坻上，深取略阳，众兵皆退，独守冲难，说得上纵横南北，屡立殊勋。他带兵有方，“制御士心，不越法度”，而且秋毫无犯，致使所在吏人，不知有军。
丧礼成，复亲祠以太牢，如宣帝临霍光故事。诏大长秋、谒者、河南尹护丧事。
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