万历四十七年（1619年）中举人，万历四十八年中进士，历任南京兵部主事、兵部郎中、太原知府、山东按察使右参政等军政要职。崇祯初年在任山东右参政时，因罪被贬为山西副使。崇祯九年（1636年）宁夏兵变，身为巡抚的丁启睿带兵捕斩了王辑等为首者六人，军心安定，因功升任右布政使，分守河南，跟随巡抚孙传庭镇压农民起义军。
崇祯十一年（1638年）冬，丁启睿升任右佥都御史，代孙传庭巡抚陕西。陕西大旱，农民起义不断。崇祯十三年（1640年），督师杨嗣昌举荐丁启睿升任兵部右侍郎，代郑崇俭总督陕西三边军务，镇压农民起义。次年升任兵部尚书，又总督湖广、河南、四川及长江南北诸军，仍兼总督陕西三边军务。
崇祯赐给丁启睿尚方剑、飞鱼服及印信。时值李自成义军围攻开封，丁启睿督催傅宗龙等人率兵讨伐，解围。12月李自成再围开封，河南巡抚高名衡飞檄报至丁启睿，他率总兵陈永福前往讨伐，陈于阵上用弓箭射中李自成左目，开封得解。1642年4月，李自成再攻开封，丁启睿调集左良玉、虎大威、方国安诸军以及保定总督杨文岳等部援救开封。
左良玉认为：“贼锋锐，未可击也”。丁启睿说：“围已急，必击之！”明军数战不利，左良玉违令引军夜奔襄阳。九月，李自成军在马家口决开黄河，水灌开封，开封失陷。丁启睿与杨文岳逃奔汝宁，义军追击400里，明军死伤无数，丁启睿的敕书、尚方剑、印绶全部丢夫，崇祯皇帝大怒，将其革职入狱，稍后，释放回原籍。
1644年5月，福王朱由崧在南京即帝位，史称南明，丁启睿攀缘阉党分子马士英，平步青云当上了兵部尚书，总督河南，负责劝农、剿寇事务，曾经擒斩李自成任命的归德府官员，后因功加太子太保。
福王政权被清军攻灭后，丁启睿脱身逃归乡里，不久病死。
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